Bakterieninfektion und PCR < Biologie < Naturwiss. < Vorhilfe
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(Frage) beantwortet  | | Datum: | 19:17 Do 25.11.2010 | | Autor: | Hajime |
| Aufgabe | | Ein Patient kommt zum Arzt und hat Verdacht auf eine Bakterieninfektion. Ihm wird Blut abgenommen und es soll eine PCR mit 2 Primern durchgeführt werden. Erläutern Sie alle dafür notwendigen Schritte in Kurzform! |
Hallo,
ich mache zur Zeit eine MTA-Ausbildung und haben dort ein Fach, dass sich „Praktische Molekularbiologie“ nennt. Gestern haben wir mit der PCR angefangen, diese theoretisch vorbesprochen und heute das erste mal durchgeführt. Anschließend wurde zur Kontrolle eine Agarosegel-Elektrophorese durchgeführt.
Unter dem UV-Licht hat man gesehen, dass die PCR geklappt hat – wir hatten eine Verdünnung mit drei Ansätzen durchgeführt und diese immer um den Faktor 10 verdünnt. Soll heißen: Ansatz 1 30ng gDNA, Ansatz 2 3ng gDNA usw. Dies konnte man auf dem Gel auch sehen.
Danach haben wir für Montag eine Hausaufgabe bekommen. Diese habe ich zwar verstanden und auch schon ausarbeitet, an einer Stelle hänge ich jedoch fest bzw. weiß nicht, ob meine Überlegungen korrekt sind.
Vorab sollte ich sagen, dass wir schon einmal eine Agarosegel-Elektrophorese, Restriktionsspaltung, Klonierung und eine DNA-Isolierung praktisch durchgeführt haben (und auch theoretisch besprochen.
Die Aufgabe:
„Ein Patient kommt zum Arzt und hat Verdacht auf eine Bakterieninfektion. Ihm wird Blut abgenommen und es soll eine PCR mit 2 Primern durchgeführt werden. Erläutern Sie alle dafür notwendigen Schritte in kurzform!“
Meine bisherigen Überlegungen:
1. Mensch ist erkrankt und der Arzt hat den Verdacht einer Bakterieninfektion
2. Blutabnahme (auch Gewebeprobe durch Biopsie möglich! PCR kann auch aus bereits fixierten Gewebe oder Zellen gemacht werden, Blutentnahme ist für Patient aber angenehmer)
3. EDTA-Vollblut: enthält Erythrozyten, Leukozyten, Thrombozyten, andere gelöste Bestandteile wie Proteine und das Bakterium
4. Isolation: Lyse der Zellen führt zur Freisetzung der DNA, dies kann mittels Salzen, Proteasen und Hitze passieren
5. DNA liegt nun in freier Form vor und ist negativ geladen. Durch Zugabe von Salzen wird sie neutralisiert und ausgefällt (kurze DNA-Fragmente entfernt), Ethanol optimiert die Bindung an das Silikagel (QIAamp)
6. QIAamp: Reinigung der DNA mit Puffer, welche Reste von Lipide, Proteinen und Kohlenhydrate entfernen. Waschen unter Hochsalzbedingungen (Zentrifuge), danach erfolgt die Trennung der DNA von der Silikamatrix
7. Eppendorfgefäß enthält nun saubere und isolierte DNA aus der Blutprobe
8. Bevor die PCR starten kann, muss Bakterien-DNA-Sequenz am Anfang und Ende bekannt sein, wichtig für die Primerherstellung
9. Die Primer, Bakterien-DNA, DNA-Polymerase, dNTP's und Magnesium werden für den Start der PCR benötigt
10. Zu Beginn liegt das DNA-Molekül als Doppenstrang vor, es erfolgt das Melting durch Hitze. Dabei brechen die Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den Basen und es entstehen zwei Einzelstränge
11. Primerhybridisierung, Primer binden an den komplementären Strang und bieten der Polymerase einen Startpunkt (freies 3'-OH)
12. Elongation, Polymerase synthetisiert den komplementären Strang immer in 5'-3'-Richtung
13. Am Ende sind zwei identische DNA-Moleküle entstanden. Erneut werden die Stränge durch Melting getrennt und erneut amplifiziert → 4 DNA-Moleküle
14. Diesen Vorgang solange wiederholen, bis genug Bakterien-DNA enstanden ist, diese kann untersucht werden, z.B. Antibiotikaresistenzgene
15. Aufgrund dieser Informationen kann dem Patient ein passendes Antibiotikum verschrieben werden → Patient geheilt
Dies waren meine bisherigen Überlegungen. In der Blutprobe liegen ja auch DNA-Moleküle der Leukozyten vor. Durch passende Primer für Bakterien-DNA würde ja nur diese amplifiziert werden, die Leuko-DNA dagegen nicht. Bei Punkt 8 bin ich mir allerdings unsicher.
Der Anfang und Ende der Bakterien-DNA muss bekannt sein, da ich die passenden Primer dazu benötige. Ich will die PCR aber machen, um herauszufinden, ob eine Bakterieninfektion vorliegt – der Arzt äußert ja nur einen Verdacht, dieser soll mit PCR bestätigt werden. Wie soll im Vorfeld die DNA-Sequenz bekannt sein, wenn nicht mal bekannt ist, welches Bakterium vorliegt?
Habe mir darauf hin dann was anderes überlebt, was wir im Unterricht mal besprochen haben. Zwar dachte ich mir, man könnte mit Restriktionsenzymen die Leuko-DNA schneiden, in der Elektrophorese auftrennen lassen, das Gel mit Bakterien-DNA ausschneiden (Skalpell) und mit QIAquick die DNA wieder aus dem Agarosegel isolieren und reinigen. Dies haben wir auch mal gemacht.
Allerdings müsste ich dann die ungefähre Basenpaarlänge der Bakterien-DNA wissen, damit ich diese im Gel identifizieren kann. Außerdem: ich kenne zwar die Sollschnittstellen der Restriktionsenzyme und kann diese so anpassen, dass sie die Leuko-DNA schneiden. Allerdings ist die Bakterien-DNA unbekannt und es könnte ja durch Zufall sein, dass dort auch Schnittstellen vorhanden sind, wo die Enzyme schneiden. Wäre dann ja kontraproduktiv, oder?
So, wie gesagt... an dieser Stelle hänge ich im Moment fest. Hat jemand eine Ahnung, wie sich das Problem lösen lässt? In meinen Unterlagen vom Unterricht finde ich nichts mehr.
Danke und viele Grüße,
Hajime
Ich habe diese Frage auch in folgenden Foren auf anderen Internetseiten gestellt:
http://www.acribio.com/forum/f3-t183-Bakterieninfektion.html
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![[willkommenmr]](/images/smileys/willkommenmr.png "[willkommenmr]")
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